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近20余年膜蛋白質組的研究成果綜述

時間:2019-10-12 來源:遺傳 作者:呂丹丹,張媛雅,葛海濤 本文字數:17551字

  摘    要: 生物膜是一類重要的亞細胞結構,含有大量的跨膜蛋白和非跨膜蛋白,負責細胞與外界的物質和信息交換以及行使細胞內的多種功能。鑒定并分析膜蛋白在生物膜上的表達是研究其功能必不可少的步驟。蛋白質組學技術可以在單次實驗中一次性從全細胞裂解物中鑒定多達上萬個蛋白質,從而為分析這些蛋白的表達提供了直接的證據。但由于膜蛋白具有較強的疏水性,從而導致對膜蛋白的蛋白質組學鑒定相對困難,這也使得對膜蛋白的結構與功能的研究進展相對比較緩慢。隨著鳥槍法蛋白質組學 (shot-gun proteomics) 及濾膜輔助的樣品制備 (filter aided sample preparation) 等為代表的現代蛋白質組學技術的快速發展,膜蛋白的鑒定水平及覆蓋率也隨之大幅提高。本文主要綜述了過去20余年在膜蛋白質組學技術上的重要進展,并以光合作用模式藍藻集胞藻 (Synechocystis sp.PCC6803) 的膜蛋白質組學研究為例,闡述了技術的進步如何提高膜蛋白鑒定的覆蓋度,以期為其他物種膜蛋白質組全覆蓋度的鑒定提供相應理論借鑒。

  關鍵詞: 膜蛋白; 蛋白質組學; 疏水性; 藍藻;

  Abstract: Membrane proteins play important functions not only as receptors and transporters, but also in many other important intracellular functions such as photosynthetic and respiratory electron transport. Identification of membrane proteins is a necessary step to understand their functions. Membrane proteins are generally highly hydrophobic and difficult to be resolved by aqueous solutions, and large-scale proteomic identification of membrane proteins has been a great technical challenge. Significant efforts have been invested in the field to improve the solubility of membrane proteins in aqueous solutions that are compatible for mass spectrometry analysis. This review summarizes the main technological achievements in the field of membrane proteomics particularly for the improvement of membrane protein identification, and uses the photosynthetic model cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803 as an example to illustrate how technology advances push forward the field in terms of the increased coverage of membrane proteome identification.

  Keyword: membrane protein; proteomics; hydrophobicity; cyanobacterium;

  生物膜主要由磷脂雙分子層和鑲嵌或附著在其上的蛋白質構成。動物、植物和微生物通常都有一種或多種膜系統。細胞質膜 (質膜) 是最為常見的一種膜系統,負責把細胞質和其他內溶物與周圍環境分隔開,并負責與環境交換物質和感受信號。除質膜外,細胞內還有多種內膜系統,如高爾基體、線粒體、葉綠體等都有一層或多層膜狀結構。葉綠體的膜系統分為被膜和類囊體膜,由外膜和內膜構成的被膜主要的作用是起到將葉綠體的內溶物與細胞質分開,并負責細胞質與葉綠體之間的物質和信息交換。類囊體膜則是光合作用的主要場所,光合電子傳遞鏈中的所有蛋白質復合體都定位于類囊體膜上,包括光合系統Ⅰ、光合系統Ⅱ、細胞色素Cyt b6f復合物以及ATP合酶復合物 (圖1) 。

  膜蛋白質是生物膜的重要組成成分,在物質運輸和信號轉導的過程中發揮著關鍵作用。據預測,一個物種的基因組所編碼的蛋白有30%是膜蛋白[1,2]。由于膜蛋白具有一些特殊的氨基酸組成并由此產生強疏水性,從而導致對膜蛋白的蛋白質組學鑒定要遠遠難于可溶性蛋白,這也使得對膜蛋白的結構與功能的研究進展相對較為緩慢。本文以一種光合作用模式藍藻集胞藻 (Synechocystis sp.PCC6803) 為例,介紹了膜蛋白的生物化學特征以及膜蛋白質組學相關技術,綜述了過去20余年膜蛋白質組的研究進展,著重闡明了技術的進步如何在提高膜蛋白質的鑒定效率及覆蓋度。
 

近20余年膜蛋白質組的研究成果綜述
 

  1、 膜蛋白生物化學特征及分離純化方法

  1.1、 膜蛋白的生物化學特征

  由于膜蛋白質在功能上的重要性以及在解析膜蛋白質組上存在的巨大技術挑戰,從蛋白質組學學科出現開始,膜蛋白質的分離和鑒定就成為了蛋白質組學研究的一個焦點方向。膜蛋白質的研究之所以具有巨大的技術上的挑戰性,最主要的原因是由于其高于一般蛋白質的疏水性。整合膜蛋白質 (integral membrane protein, IMP) 一般都通過一個或多個跨膜結構域 (transmembrane domain, TMD) 而整合在膜上,跨膜結構域大小一般在20個氨基酸殘基左右,主要由疏水氨基酸組成,可以和膜的重要組成成分 (磷脂雙分子層) 發生疏水相互作用,從而將蛋白質固定到膜上[3,4]。除了IMP,生物膜通常還含有大量的周邊膜蛋白 (peripheral membrane protein, PMP) 。PMP不含跨膜結構域,與膜的結合主要是通過蛋白質–蛋白質或者蛋白質與脂類的相互作用 (圖1) 。有些蛋白質還會發生翻譯后修飾,并通過修飾集團與膜的相互作用而結合到膜上。常見的化學修飾主要有磷酸肌醇修飾、粽櫚酰化、豆蔻酰化等。蛋白質與膜的相互作用一般可以分為共價和非共價兩種類型。共價相互作用非常穩定,磷酸肌醇修飾的蛋白與膜的結合可以看作是一種共價的結合,結合非常穩定,很難從膜上被分離[5,6]。而很多蛋白質–蛋白質之間的相互作用通常是非共價的,包括氫鍵、靜電相互作用、疏水相互作用以及范德華力等。這些非共價的相互作用可以介導蛋白質形成復合體。通常很多PMP通過和一個或多個IMP共同形成復合體而結合在膜上。PMP與膜的結合一般是可逆的,其結合穩定度通常隨細胞內微環境的變化而變化。對于通過生物化學方法分離的懸浮在緩沖液中的生物膜,如果改變緩沖液鹽離子濃度或pH值,都有可能有效地將PMP從生物膜上解離下來。

  圖1 藍藻類囊體膜結構示意圖
圖1 藍藻類囊體膜結構示意圖

  Fig.1 Schematic diagram of cyanobacterial thylakoid membrane

  類囊體膜是光合作用的主要場所,與此相關的一些主要的蛋白復合物如光合系統Ⅰ (PhotosystemⅠ) 、光合系統Ⅱ (PhotosystemⅡ) 、ATP合酶 (ATP synthase) 以及與CO2固定相關的NDH-13和NDH-14復合體均分布在類囊體膜上。這些膜蛋白質復合物既包含IMP, 又包含PMP。

  疏水性是膜蛋白的一個重要生物化學特征。評價疏水性的關鍵指標有兩個:第一個指標是分析其是否含有跨膜結構域及其數目。所有的IMP都有一個或多個跨膜結構域,通常一個膜蛋白如果所含的跨膜結構域數目越多,表明其疏水性越強,但有時也例外,因為膜蛋白整體疏水性還會受到連接跨膜結構域的膜外區域大小的影響。一個蛋白是否含有跨膜結構域及其數目的多少可以通過生物信息軟件進行預測,常用的軟件是基于隱馬爾可夫模型的TMHMM,其預測IMP的準確度可以超過97%[7]。需要指出的是TMHMM目前有兩個版本,即TMHMM1和TMHMM2。本課題組在具體的研究中發現,TMHMM2在預測某些蛋白的跨膜結構域時反而不如TMHMM1準確。第二個指標就是蛋白質的GRAVY值。GRAVY值是從總體上評價一個蛋白質疏水性高低的參數。一般來說一個蛋白質的GRAVY值越高,表明其疏水性越強[8]。一個蛋白質的GRAVY值取決于其氨基酸序列的構成。每個不同的氨基酸殘基都有一個特定的疏水值 (hydropathy score) ,疏水性最高的為異亮氨酸 (4.5) ,其次為纈氨酸 (4.2) ,而親水性最高的是精氨酸 (-4.5) ,其次為賴氨酸 (-3.9) 。一般來說,側鏈為長脂鏈的氨基酸其疏水性越高,而側鏈為極性的尤其是帶電荷的氨基酸,其親水性越強。GRAVY值就是該蛋白質所有氨基酸疏水值的平均值,即所有氨基酸疏水值的加和除以該蛋白質的長度 (所含氨基酸的數量) 。

  1.2、 膜及膜蛋白的分離純化

  盡管一個基因組所編碼的蛋白有30%被預測為膜蛋白,但總體上由于膜蛋白豐度較低,且不易在水溶液中溶解,因此在進行膜蛋白質組學分析時,經常需要先對膜組分進行分離純化,以富集低豐度的膜蛋白。在一個全細胞裂解物中,由于膜組分的密度不同,在密度梯度離心中具有不同于可溶性組分的沉降系數,借此可以與可溶性組分分離開。對于各種細胞器如線粒體、葉綠體來說,一般都是先分離該細胞器,然后再分離其各個膜組分。以葉綠體為例,葉綠體含有3個膜組分:組成葉綠體包被的外膜、內膜和類囊體膜。葉綠體的包被可以利用一種叫做Yeda Press的裝置剝離下來,并通過密度梯度離心分離外膜和內膜[9,10,11,12,13,14,15]。被剝離包被的葉綠體可以被直接裂解,并通過離心獲得類囊體膜。

  純化的膜組分既含有IMP, 又含有PMP。由于IMP難溶于水溶液且一般豐度較低,因此難以被現有的蛋白質組學技術鑒定。為提高IPM蛋白質組學鑒定的覆蓋度,通常需要將水溶性較高的PMP與IPM分離以便富集IPM。常見的分離方法有如下幾種: (1) 高濃度鹽溶液抽提法,即利用高濃度的鹽溶液(如1 mol/L NaCl)來解離與膜結合的PMP[16]。這種方法的原理是利用鹽離子所帶的電荷,破壞介導PMP與膜相結合的靜電相互作用,從而將PMP從膜上洗脫到溶液中。經過1 mol/L NaCl抽提后的膜所含的PMP顯著減少,而IMP會因此得到顯著的富集; (2) 高pH抽提法。細胞裂解后,膜組分由于磷脂雙分子層的疏水性,在水溶液中通常是以囊泡的形式存在。這些囊泡在形成過程中會把一部分可溶性蛋白包含進去,這樣在分離純化的膜組分中就會造成可溶性蛋白的污染。用100 mmol/L Na2CO3溶液 (pH11.0) 抽提純化的膜組分,可以將這些囊泡狀的膜組分剪切開,形成片狀,釋放其中所包含的可溶性的污染蛋白[10]。同時,由于高pH值可以改變蛋白質在水溶液中的電離效率,從而改變蛋白質所帶的電荷,影響蛋白質之間的靜電相互作用,并因此將PMP從膜上解離下來,達到分離PMP與IMP的效果; (3) 離液劑 (chaotropes) 抽提法。常用的離液劑是高濃度 (8 mol/L) 的尿素 (urea) 。尿素是一種強極性的試劑,很容易與水及水溶液中的蛋白質形成氫鍵,從而破壞蛋白質之間的相互作用,把PMP從膜上解離出來。除尿素外,硫脲 (thiourea) 是一種更強的離液劑,也經常在蛋白質組學研究中用來溶解蛋白質[17,18]; (4) 二相分離法 (two phase partition) 。含有去垢劑Triton X-114在0℃時會形成均一的水溶液,當溫度升高到20℃時,溶液就會分層,上層是水相,下層是去垢劑相。這時溶解在Triton X-114溶液中的膜蛋白也會隨著分層,水相中主要包含可溶性蛋白,如容易從膜上解離的PMP,而去垢劑相中主要包含和膜結合緊密的PMP以及IMP[19]。需要注意的是,這些方法并不一定是單獨使用,在實際研究中通常會把多種方法結合起來使用,以達到提高分離效率的目的。

  2、 膜蛋白質組學相關技術

  2.1、 雙向電泳與膜蛋白質組學

  雙向電泳 (2D electrophoresis, 2DE) 是早期蛋白質組學研究最重要的技術之一,可以和MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry) 質譜技術結合 (2DE-MS) ,進行大規模快速的蛋白質鑒定[17,18]。雙向電泳本質上是一種蛋白質分離技術,可以把高復雜度的樣品,如含有數萬個蛋白的全細胞裂解物中的蛋白盡可能地分開[20]。一般來說,雙向電泳的第一向為等電聚焦 (isoelectric focusing, IEF) ,即根據蛋白質的等電點進行分離。蛋白質由氨基酸組成,在不同的酸堿環境下會發生不同程度的電離,因此蛋白質所處環境的pH值不同,其電離程度以及所帶的凈電荷也不同。在一個特定的pH值下,該蛋白質發生電離使得其所帶的凈電荷為0,該pH值即為該蛋白質的等電點。雖然所有的蛋白質都有一個特定的等電點,但一旦該蛋白質發生翻譯后修飾,其等電點則也有可能改變, 因此在2DE中很多蛋白質會在電泳膠上形成分子量相等的多個點[17,18]。等電聚焦的本質就是讓蛋白質在高電壓的作用下在一個pH梯度中進行遷移,當蛋白遷移到pH梯度中與其等電點相等的位置時,由于其所帶的凈電荷為0,不再受到電場力的作用,從而停留在該位置。一般商業化的IEF膠條都是帶有固定化的pH梯度,可以最大限度地提高實驗結果的重復性。對于多種蛋白質來說,由于其等電點有所不同,因此其停留的位置也有所不同。等電聚焦就是通過這個原理對蛋白質進行分離的。需要指出的是,等電聚焦要想達到很好的分離分辨率,必須要排除環境中的帶電離子對蛋白質遷移的影響。因此,等電聚焦的緩沖液不能含有鹽離子,最理想的遷移環境就是電場中所有的電荷都來源于蛋白質自身。雙向電泳的第二向是SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 。SDS-PAGE主要是根據分子量的大小對蛋白質進行分離。等電聚焦完成以后,可以把含有蛋白質的IEF膠條水平地轉移到SDS-PAGE凝膠頂端并用瓊脂糖凝膠固定住。在電場力作用下,蛋白質從IEF膠條中垂直進入到SDS-PAGE膠中,進行第二向分離。

  2DE的分辨率和IEF膠條以及SDS-PAGE的尺寸呈正相關。尺寸越大,分辨率越高,同時蛋白質樣品的上樣量也越大,可以更好地鑒定低豐度蛋白。雖然大尺寸的雙向電泳 (如24 cm IEF膠條) 理論上可以將多達1000個以上的蛋白高分辨地呈現在一塊凝膠上,但一般而言2DE能分離的蛋白通常都是親水性的可溶性蛋白,而高疏水性的尤其是含有跨膜結構域的蛋白,絕大部分都不能被雙向電泳所分離。這是因為膜蛋白的溶解通常需要有去垢劑的輔助。去垢劑通常都有一個非極性的基團和一個極性的基團,非極性的基團和蛋白質發生相互作用,而極性基團和溶液中的水發生相互作用,從而幫助蛋白質溶解。不同的去垢劑輔助蛋白質溶解的能力是不同的,目前已知的助溶能力最強的去垢劑是SDS,但SDS帶有負電荷,蛋白質一旦結合大量的SDS后,SDS本身的負電荷就會干擾等電聚焦,因此SDS與蛋白質的等電聚焦是不兼容的。通常與等電聚焦兼容的去垢劑都是非離子性的 (如Triton X-100和NP-40) ,或者是雙性的 (zwitterionic) ,即同時帶一個正電荷和一個負電荷,總電荷為0,如常用的CHAPS和ASB14都是雙性去垢劑。遺憾的是,這些去垢劑的助溶能力遠遠低于SDS,因此絕大多數高疏水性的膜蛋白都無法被雙向電泳分離[21,22,23]。

  2.2、 基于LC-MS的膜蛋白質組學

  基于美國科學家John Yates實驗室在研發基于色譜–質譜聯用 (liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS) 的鳥槍法蛋白質組學 (shot-gun proteomics) 技術上取得的卓越成就[24,25],鳥槍法蛋白質組學技術逐漸取代2DE-MS技術,成為高通量蛋白質組學分析的主流技術。基于LC-MS的鳥槍法蛋白質組學技術的核心策略是依靠LC分離蛋白質經特異性內切酶如胰蛋白酶酶切后產生的肽段,然后經電噴霧技術離子化后進入質譜進行分析。該技術的優點是通量高、容易自動化,更為重要的是酶切后產生的肽段可以根據不同原理的利用LC進行多維分離而降低樣品的復雜度,如肽段可以首先被強陽離子交換LC進行第一維分離,所收集的每個餾分可以經反相LC進行第二維分離。這種多維分離技術與MS結合可以極大限度地提高蛋白質組鑒定的覆蓋度。

  在膜蛋白質組學方面,由于基于2DE-MS的方法很難兼容高疏水性的膜蛋白,因此該方法在膜蛋白的高通量鑒定和定量上被逐漸舍棄,而基于LC-MS的膜蛋白質組技術在不斷地推陳出新。早期比較成功的技術是由John Yates實驗室發表的高pH溶液抽提結合非特異性酶切的方法。該技術的關鍵是先利用pH 11.0的Na2CO3將提純的囊泡狀膜組分打開,形成片狀膜組分。然后利用非特異性的蛋白酶Proteinase K對片狀膜組分進行不完全消化,這樣兩個跨膜區之間的膜外區域便會被切成大小不一的肽段,可以利用LC-MS進行鑒定[14]。該方法有兩個優點:第一是高pH緩沖液打開了囊泡狀膜結構,使得包含在囊泡內部的膜外區域也被暴露在水溶液中,從而可以被蛋白酶消化成小片段肽段,這樣就可增加膜蛋白質被分析的區域,提高氨基酸序列鑒定的覆蓋度。這對小的膜蛋白尤其是膜外區域很小的膜蛋白具有重要的意義;第二個優點是使用非特異性的蛋白酶來進行消化。由于很多膜蛋白的膜外區域很小,沒有合適的特異性內切酶如胰蛋白酶的識別為點,這樣可能造成膜外區域不能被酶切,或酶切所產生的肽段片段過大,不能被LC-MS有效地分析。利用這種方法,454個含有預測TMD的蛋白被從腦組織裂解物中鑒定出來,雖然這些蛋白質很多都只含一個TMD,但相較基于2DE的方法來說,在膜蛋白質的鑒定上已經有了本質的提高[14]。

  利用高pH結合非特異性Proteinase K部分酶切的方法雖然能顯著提高膜蛋白的鑒定效率,但這種方法也有一定的弊端。首先,酶切是非特異性的,所得到的肽段的長度較難控制,并且肽段的C-端沒有特異性酶切所產生的標志性氨基酸殘基,如胰蛋白酶酶切后所產生的K或R,不利于后續的質譜分析。其次,由于非特異性酶切片段長短的隨機性,同一個蛋白在不同的樣品中,甚至在同一個樣品的不同技術重復中,經過酶切所產生的肽段也是不一樣的,這樣樣品之間就很難進行定量比較,尤其是不利于基于標記的如SILAC (stable-isotope labelling by amino acids) 或iTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantification) 的定量蛋白質組學研究。因此,該技術事實上并沒有在具體的研究中得到廣泛的應用。

  上述幾種方法均不需要將膜蛋白真正溶解在溶液中,而是利用非特異性的酶部分消化暴露在膜外的區域。在膜蛋白質組學研究方面,研究的主流思路還是希望能把膜蛋白溶解在溶液中,然后再進行后續的分析。和基于2DE的技術一樣,使用溶解能力強的去垢劑是溶解膜蛋白的最為直接也是最重要的手段。目前已知的溶解能力最強的去垢劑是SDS,但由于SDS自身帶有電荷且和蛋白質結合緊密,不易去除,因此不能兼容于后續的LC-MS。如何去除蛋白質樣品中的SDS因此成了很多蛋白質組學研究者孜孜不倦以求攻克的一個難題。本課題組曾經觀察到用1%SDS溶液裂解的全細胞裂解液保存在4℃時,SDS會發生沉淀,可以通過離心予以去除。因此嘗試是否能利用這個現象去除蛋白質樣品中的SDS,但經過多次實驗后發現,利用這種辦法雖然能有效地去除SDS,但也有很多的蛋白質隨著SDS一同沉淀,造成很大的樣品損失。德國科學家Mann實驗室在2009年發表了一種更為有效的從蛋白質樣品中去除SDS的方法,稱之為濾膜輔助的樣品制備 (filter aided sample preparation, FASP) [26]。該方法的基本原理是先利用高濃度的SDS裂解液,如2%或4%SDS裂解液,把蛋白質溶解出來。這種高濃度的SDS裂解液幾乎能溶解所有的膜蛋白。含有SDS的蛋白質樣品然后轉移到超濾管進行溶液置換。超濾管的濾膜具有很多小孔,孔徑的大小決定可以濾過的蛋白質分子的大小。通常用來做FASP實驗的超濾膜其孔徑大小的域值小于30 kDa,也就是小于30 kDa的蛋白質分子才能通過。域值越小,能通過的分子越小,但溶液置換所需的時間越長。其實30 kDa也是一個經驗值。由于蛋白質分子已經結合了很多的SDS分子,且其空間構象也發生了變化,因此30 kDa域值的超濾膜也能有效地阻擋10 kDa以上的蛋白質通過。在超濾管中,可以向蛋白質樣品加入8 mol/L的尿素來稀釋樣品。尿素作為一種很強的離水劑,可以把結合在蛋白質上的SDS置換出來,同時保持蛋白質的溶解狀態[27,28]。通過離心,讓置換出來的SDS透過濾膜而得到去除,同時樣品得到濃縮。濃縮后的樣品再次加入8 mol/L尿素稀釋以置換和去除殘余的SDS。重復數次,便能有效地去除樣品中的SDS。最后將樣品中的尿素稀釋到2 mol/L,便能進行后續的DTT還原、碘乙酰胺烷基化以及蛋白酶消化等處理,得到的酶切肽段樣品能完全兼容LC-MS分析。FASP方法不但能有效地鑒定膜蛋白,事實上對所有的蛋白都非常有效。因此,FASP方法已經成為蛋白質組學實驗樣品處理的一種最常用的方法。需要指出的是,利用超濾管去除SDS的思想并不是Mann實驗室第一個提出,在此之前,Manza等[29]也提出了類似的方法,但由于在其他細節上有所不同,該方法去除SDS的效率似乎沒有FASP方法好。兩個研究團隊也因為該方法的原創性有所爭議[12],但就去除SDS的效率以及在該方法的推廣上,Mann實驗室應該是貢獻更大。

  FASP雖然在膜蛋白質的處理上具有極大的優勢,但也并非完美無缺,一方面該方法需要在超濾離心管中進行多次的溶液交換,會增加實驗的成本和時間,另一方面該方法會造成嚴重的樣品損失。事實上,第二個方面造成的后果更嚴重,正如Manza等[29]所指出的,該方法在處理小于50 g的樣品時,所能回收的肽段的量很少,很可能是肽段被吸附在濾膜上而造成了損失。為了克服這個問題,Ma等[13]提出了另外一種方法,即SCAD法 (surfactant and chaotropic agent assisted sequential extraction/on pellet digestion) 法。該方法同樣也是先用SDS溶液裂解細胞,往裂解液中加入冰冷的丙酮 (80%,V/V) 過夜沉淀蛋白質,然后再用冰冷的80%丙酮洗2 h。經離心去除丙酮后干燥樣品,用8 mol/L尿素重新溶解蛋白質。利用SCAD方法,作者聲稱能獲得更高的肽段回收率和媲美FASP方法的膜蛋白鑒定效率,該方法尤其適合微量樣品的蛋白質組學分析。不過,本課題組在經過多次嘗試后,發現SCAD方法和FASP法比起來并無明顯優勢,尤其在處理微量樣品時,由于需要用丙酮沉淀蛋白質,會造成一定的樣品損失。因此,在日常蛋白質組學實驗中,FASP方法還是處理樣品的首選方法。

  3、 光合模式藍藻集胞藻的膜蛋白質組學研究進展

  3.1、 集胞藻簡介

  集胞藻是一種單細胞的光合藍藻,也是一種重要的光合作用研究的模式生物。作為模式生物,集胞藻有如下幾個優點:第一,集胞藻和高等植物的葉綠體高度類似,都具有包括類囊體膜在內的多種膜結構,其光合電子傳遞鏈也和高等植物類似;第二,集胞藻的基因組在所有的藍藻中是第一個被測定的[30],其遺傳背景相較其他藍藻更為清楚;第三,集胞藻具有天然的吸收外源DNA的能力,并能通過同源重組將外源DNA整合到自身的基因組上,非常容易進行遺傳轉化[31]。因此,在研究基因功能時非常容易和方便地對基因進行敲除和敲入。這些優勢在進行功能蛋白質組學研究時非常重要,可以方便地對新發現的具有潛在功能的蛋白質進行遺傳操作來驗證功能。此外,集胞藻作為一種藍藻,在工業上也具有重要的應用價值,可以利用其自養的特性,通過光能固定空氣中的CO2來生產清潔的可再生能源和其他有用的代謝物[32,33]。目前,在合成生物學方面,集胞藻正在作為一種重要的底盤生物進行開發和利用[34]。

  和其他藍藻一樣,集胞藻具有多種膜結構,由外向內,包括細胞壁的外膜、質膜和多層的類囊體膜。其中質膜根據其在密度梯度離心上的浮力密度不同,又可分為低密度質膜和普通質膜[35]。各種膜結構上所含的蛋白質在很大程度上決定其功能,如外膜上有很多通透性高的孔道蛋白 (porin) ,負責細胞與外界的物質交換。質膜上有很多轉運蛋白,負責有選擇性地把外界物質如各種離子運輸到細胞內。類囊體上有完整的光合電子傳遞鏈,負責光合作用。需要指出的是,藍藻類囊體上也有完整的呼吸電子傳遞鏈,且部分構成成分與光合電子傳遞鏈重合[36]。這一點與高等植物的類囊體不同,后者只具有光合電子傳遞鏈,而呼吸鏈則位于線粒體中。當然,各個膜組分上的蛋白質構成并非完全不同,如質膜上也有部分呼吸鏈和光合鏈的蛋白[37]。因此,鑒定這些膜組分的蛋白構成,對于理解其功能至關重要。利用膜蛋白質預測軟件TMHMM預測,集胞藻的基因組編碼892個含有預測TMD的蛋白,當然其中有一部分只含有一個TMD的蛋白質可能并不是真正的IMP,而是含有信號肽的可溶性蛋白。

  3.2、 集胞藻膜蛋白質組學研究進展

  集胞藻的膜蛋白質學的研究始于1997年,日本的研究團隊在完成集胞藻基因組測序后,開始進行其蛋白質組學研究。他們利用2DE結合N-端測序和MS的方法,分析了集胞藻的全細胞裂解物的蛋白質組和分離出來的類囊體蛋白組,共鑒定了不到100個蛋白質,只有少數幾個蛋白含有預測的TMD[38,39]。隨后,本文作者之一汪迎春研究員在做博士論文期間,利用2DE-MS方法,試圖系統地解析分離的集胞藻膜組分的蛋白質組。需要指出的是,這個膜組分是經過差異離心去除可溶性組分后獲得的膜組分沉淀,包含外膜、質膜和類囊體膜,只不過類囊體膜占絕大部分[17]。在經過長時間的方法優化,嘗試了各種離水劑和去垢劑的組合后,他發現2DE對于溶解膜蛋白效率非常低,鑒定的蛋白只有少數幾個含有預測的TMD,而這些TMD還很有可能是信號肽[17,18]。由于2DE結合MALDI-TOF的方法是早期蛋白質組學研究的主流技術,因此可以預見早期集胞藻的膜蛋白質組學研究是困難重重。但在這領域也并非沒有亮點,這個時期最主要的亮點來自于對集胞藻各種膜組分的生化分離。1998年瑞典斯德哥爾摩大學的Norling等發明了一種液相二相分離法,二相分別為水溶性的多聚物Dextran-500 (5.8%) 和polyethylene glycol 3350 (5.8%) 組成,根據各種膜組分表面的物理化學性質不同,對不同的膜組分進行分離[40]。利用二相分離法結合密度梯度離心技術,Norling的學生黃芳博士 (現為中國科學院植物研究所研究員) 分離純化了質膜和外膜,并進行了基于2DE-MS的蛋白質組學分析[41,42]。純化的類囊體膜蛋白質組也隨后由Norling實驗室分析并發表[43]。同樣,由于2DE-MS在分析膜蛋白質上存在的先天性的技術缺陷,這些蛋白質組學研究所鑒定的IMP數量也很少。鑒于這個原因,Norling實驗室與韓國的Choi團隊合作,嘗試用不同的技術來解析膜蛋白質組。他們開發了一種高溫酸剪切結合特異性酶切的技術[44]。該技術主要是用10 mmol/L TCEP與30%的乙腈和25%甲酸水溶液按1∶1比例混合而得到的溶液在95℃處理膜樣品,膜蛋白質在溶解的同時,其天冬氨酸殘基的N-端和C-端都能得到剪切,產生小于10 kDa的肽段,這些肽段經進一步胰蛋白酶和chymo胰蛋白酶酶切后,產生更小的適合LC-MS分析的肽段。利用這種方法,他們一共鑒定了155個IMP[44],和之前的報道相比,該方法所鑒定的IMP的數量有了很大的提高,但和集胞藻全基因組編碼的IMP比起來尚不足20%。

  鑒于集胞藻在光合作用和清潔能源研究上的重要性以及在膜蛋白質組學研究上的挑戰性,本課題組建立蛋白質組學實驗室后又重新從事該領域的研究。2014年,本課題組利用FASP方法結合基于LC-MS的多維蛋白質組學方法,定量分析了集胞藻ORF slr0110的一個敲除突變體的蛋白質組,共鑒定了409個IMP,占全基因組編碼的IMP的50%左右,這其中有232個IMP包含2個或以上的TMD。與以往的研究相比,在IMP鑒定覆蓋度方面有了巨大的提升。同時本課題組所鑒定的IMP在跨膜區數量的分布上沒有表現出明顯的偏好,從一個跨膜區到最多的18個跨膜區的IMP鑒定率都在50%左右[45]。這些結果也充分說明了FASP方法在膜蛋白質組學研究上的巨大優勢。

  盡管本課題組在集胞藻IMP鑒定的覆蓋度上取得了長足的進步,但還有大約400個IMP不能在單次實驗中得到鑒定。鑒于此,本課題組系統地分析了集胞藻所有從未被鑒定過蛋白的特性,發現這些蛋白主要是小蛋白和疏水性的蛋白,后者主要是IMP[46]。因此,推測這些未被鑒定的IPM太小,沒有合適的特異性蛋白酶切位點,從而逃脫了基于LC-MS的鳥槍法蛋白質組學鑒定;另一個可能的原因是IMP表達量太低,目前的LC-MS技術因靈敏度不夠而不能被鑒定到。對于該原因,我們推測如果將各個膜組分分離純化,這樣使得各個膜組分尤其是含量處于絕對劣勢的外膜和質膜與含量上處于絕對優勢的類囊體膜分開,這樣就可以使外膜和質膜上的蛋白質得到富集,從而有可能使得一些低豐度的膜蛋白得到鑒定。本課題組和黃芳團隊合作,從野生型的集胞藻中分離了外膜、低密度質膜、普通質膜、類囊體膜以及可溶性組分,利用基于LC-MS的無標記定量蛋白質組學技術對這5個組分進行了分析,共鑒定到2167個蛋白,其中594個蛋白為IMP,使得單次實驗集胞藻IMP鑒定的數量達到了前所未有的高度 (待發表) 。由于此次實驗所用的膜組分樣品量較少,并沒有進行樣品消耗量較大的多維蛋白質組學分析。后續實驗將大量制備各個膜組分并對每個組分進行多維蛋白質組學鑒定,預期所鑒定的IMP的數量還會有進一步提高。需要指出的是,在某個特定的條件下并非所有的編碼蛋白的基因都會表達,因此在同一個實驗條件下也就無法把集胞藻所有的IMP都鑒定出來。如果想要再進一步提高IMP鑒定的覆蓋度,就需要在不同的條件下培養集胞藻。已有證據表明有些IMP的表達是環境誘導型的,如負責CO2轉運的蛋白cmpABCD,其表達就是受低CO2濃度誘導[47,48]。利用此次無標記定量的蛋白質組學實驗結果,本課題組對所鑒定的蛋白,包括IMP在各個組分上分布的相對豐度進行了定量。依此定量信息,就能獲得某個蛋白在細胞內定位的信息,既可能特異性定位在某一個亞細胞結構,也可能分布在多種亞細胞結構上。本課題組一共對2027個集胞藻蛋白進行了亞細胞定位,并將該信息儲存在一個網絡數據庫以供從事藍藻研究的科學家檢索 (http://protdb.genetics.ac.cn/atlas/index.html) (圖2) 。

  生物膜上除了含有IMP外,還有大量的PMP。在分離膜組分的時候,和膜結合穩定的PMP一般會隨膜一起分離出來,而與膜結合不穩定的有時會從膜上解離下來。此外,膜組分在分離時不可避免地會遭到一些可溶性蛋白的污染,這些污染蛋白并不是PMP,且與膜的結合是非特異性的。如何區分從膜組分中鑒定出來的PMP和污染蛋白一直是一個技術上的挑戰,也是開展對PMP功能的研究需要解決的首要問題。因此,本課題組設計了一個方法用于區分真正的PMP和污染蛋白。該方法基于如下的一個假想:所有的非IMP蛋白,在細胞內都有兩個池 (pool) ,一個是結合在膜上,一個是在可溶性組分。如果一個蛋白和膜結合得很緊密,那么它在膜上的池就較大,在可溶性組分中的池就較小,反之亦然。如果一個蛋白和膜結合得越緊密,那么它越有可能是PMP,反之則越有可能是可溶性污染蛋白。基于這個假想,本課題組定量分析了野生型集胞藻膜組分和可溶性組分的蛋白質組,并利用表征蛋白質豐度的兩個質譜學參數 (質譜信號強度和譜圖匹配數) 來計算蛋白質在膜組分和可溶性組分中豐度的比值,并依此作出二維散點圖[16]。和膜結合越緊密的蛋白,其膜組分/可溶性組分的信號強度和譜圖匹配數的比值就越大,其在散點圖上的位置就越靠近右上角。如光合系統Ⅰ的非IMP組分PsaC、PsaD和PsaE等與膜結合非常緊密,因此位于右上角,ATP合酶的亞基AtpA和AtpB與膜的結合稍弱,處于中間,而藻膽體非常不穩地,其多個亞基如CpcA和CpcB處于左下方 (圖3) 。污染蛋白和膜結合的緊密度一般較低,其比值較小,因此都分布于左下角[16]。該方法為判斷某個蛋白是否是PMP提供了定量依據。需要指出的是,PMP與膜結合的緊密度不是一成不變的,而是隨著環境的變化而變化。這也是細胞內各種生理生化反應以及信號轉導的一個重要調控方式。

  4、 結語與展望

  現代蛋白質組學技術的快速發展使得大多數膜蛋白組研究上存在的難題正在被一一克服,在藍藻的膜蛋白質組學研究進展也同樣如此。這使得絕大數IMP都能被現代蛋白質組學技術鑒定到。但目前仍存在兩個主要的問題:第一是IMP跨膜區很難被鑒定到,這主要是由于跨膜區強疏水性以及缺少合適的特異性酶切位點造成的。跨膜區一般不含胰蛋白酶特異識別的精氨酸和賴氨酸位點,因此需要選擇不同的特異性內切酶才能獲得可用于質譜分析的肽段;第二是很多IMP是只含一個跨膜區的小蛋白,沒有合適的酶切位點,也不適合基于鳥槍法的蛋白質組學鑒定。對于這種小蛋白,目前新興的從上而下的蛋白質組學 (top-down proteomics) 也許是個更好的技術選擇。從上而下的蛋白質組學方法在進行質譜分析前,不需要將完整的蛋白質切成小的肽段,直接以蛋白質本身為分析檢測對象,因此可以更完整、豐富和準確地提供分析對象的生物學信息。同時,從上而下的蛋白質組學方法也彌補了鳥槍法蛋白質組分析鑒定的一些不足,在小分子量或缺少蛋白酶酶切位點的蛋白質鑒定方面也許會有更大的優勢[49,50,51]。因此,有理由相信在不久的將來將會實現對膜蛋白質組全覆蓋度的鑒定。

  圖2 集胞藻可溶性蛋白與膜結合強度的評估
圖2 集胞藻可溶性蛋白與膜結合強度的評估

  Fig.2 Evaluation of the tightness of membrane association for non-transmembrane proteins

  綠色箭頭線段所示,沿綠色箭頭方向,蛋白與膜結合的緊密程度依次遞增或遞減。圖中顯示光合系統Ⅰ的亞基 (綠色散點) 、ATP合酶的亞基 (藍色散點) 以及藻膽體的亞基 (紅色散點) 與膜結合的強度依次遞減。

  圖3 集胞藻蛋白質地圖集網絡數據庫
圖3 集胞藻蛋白質地圖集網絡數據庫

  Fig.3 The Proteome Atlas of Synechocystis

  數據庫提供一個搜索引擎,用戶可以輸入要檢索的蛋白,如圖中所示的光合系統Ⅰ蛋白PsaA,該蛋白在各亞細胞結構上的相對豐度 (柱狀圖) 以及其他結構和功能信息被顯示出來。

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